Ερευνητές ανέπτυξαν μια τεχνική που μεγεθύνει βιολογικά δείγματα κατά ένα δισεκατομμύριο φορές σε όγκο, επιτρέποντας σε συμβατικά οπτικά μικροσκόπια να εντοπίζουν μεμονωμένα αμινοξέα στις πρωτεΐνες. Η πρωτοποριακή μέθοδος δημοσιεύθηκε σε προεκτύπωση στο bioRxiv και ανατρέπει τα δεδομένα στη δομική βιολογία.
Πώς λειτουργεί η επέκταση κατά χίλιες φορές
Η τεχνική βασίζεται σε ένα πολυμερές παρόμοιο με αυτό που χρησιμοποιείται στις πάνες για την απορρόφηση υγρών. Οι επιστήμονες τοποθετούν τα βιολογικά δείγματα σε ένα ειδικό υδρογέλη και στη συνέχεια τα διογκώνουν σε τρεις διαστάσεις, επιτυγχάνοντας μεγέθυνση 1.000 φορές σε κάθε άξονα. Η συνολική αύξηση όγκου φτάνει το ένα δισεκατομμύριο φορές — αρκετό για να μετατρέψει ένα μεμονωμένο κύτταρο σε μέγεθος εγκεφάλου ποντικιού και ένα δείγμα στο μέγεθος δεκάρας των ΗΠΑ σε αναλογία ολυμπιακής πισίνας.
«Αυτός είναι ο εκδημοκρατισμός της δομικής βιολογίας», δήλωσε ο Σίλβιο Ριτσόλι, νευροεπιστήμονας και ειδικός στην απεικόνιση στο Πανεπιστημιακό Ιατρικό Κέντρο του Γκέτινγκεν (UMG) στη Γερμανία και συν-συγγραφέας της μελέτης.
Μέχρι σήμερα, η παρατήρηση μορίων σε τόσο λεπτομερή κλίμακα απαιτούσε δαπανηρές και πολύπλοκες τεχνικές όπως η κρυογενική ηλεκτρονική μικροσκοπία (cryo-EM) και η κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ. Η νέα μέθοδος υπόσχεται να καταστήσει προσιτή τη δομική ανάλυση πρωτεϊνών σε οποιοδήποτε εργαστήριο διαθέτει ένα συμβατικό φθορίζον μικροσκόπιο.
Από τη μικροσκοπία επέκτασης στην ατομική ανάλυση
Το 2015, ο νευρομηχανικός του MIT Έντουαρντ Μπόιντεν, επίσης συν-συγγραφέας της νέας μελέτης, εφηύρε την αρχική μέθοδο «μικροσκοπίας επέκτασης». Χρησιμοποιώντας ένα διογκούμενο υδρογέλη, η ομάδα του κατάφερε να μεγεθύνει δείγματα ιστών περίπου τέσσερις φορές σε κάθε διάσταση, μετακινώντας τα κυτταρικά συστατικά μακριά το ένα από το άλλο και βελτιώνοντας την ανάλυση.
Από τότε, οι ερευνητές προσάρμοζαν τη μέθοδο για μεγαλύτερες διογκώσεις, αλλά συνήθως περιορίζονταν σε περίπου 20 φορές. Για να ξεπεράσουν αυτό το όριο, η ομάδα ανέπτυξε μια νέα συνταγή υδρογέλης όπου τα δείγματα διογκώνονταν πολλαπλές φορές. Χρησιμοποίησαν επίσης μια παραλλαγή που ονομάζεται ONE microscopy για να χαρτογραφήσουν πρωτεϊνικές δομές. Οι καθαρισμένες πρωτεΐνες συνδέονταν με το υδρογέλη και στη συνέχεια τεμαχίζονταν με ένζυμα ή θερμότητα, επιτρέποντας στις πρωτεΐνες να τεντωθούν χωρίς να διακυβεύεται η τρισδιάστατη δομή τους.
Χαρτογράφηση αμινοξέων σε πρωτεΐνες
Με τη μέθοδο επέκτασης 1.000 φορών, οι ερευνητές επισήμαναν αρκετά από τα εννέα μεμονωμένα αμινοξέα που αποτελούν ένα πεπτίδιο που ονομάζεται mCLING. Στη συνέχεια, απεικόνισαν τις σχετικές θέσεις αυτών των δομικών λίθων χρησιμοποιώντας ένα φθορίζον μικροσκόπιο. Οι μετρήσεις ήταν συνεπείς με τις δομές του mCLING που προέκυψαν από υπολογιστικές προσομοιώσεις.
Η μέθοδος αποκάλυψε επίσης τη δομή μιας πρωτεΐνης που ονομάζεται νανοσώμα (μια μικρή εκδοχή ενός αντισώματος), καθώς και τις θέσεις μερικών από τα αμινοξέα της. Επιπλέον, οι επιστήμονες χρησιμοποίησαν την τεχνική για να χαρτογραφήσουν τη δομή της πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (GFP), ενός βιοτεχνολογικού εργαλείου που χρησιμοποιείται ευρέως για τη σήμανση άλλων πρωτεϊνών.
Οι ερευνητές εκτιμούν ότι το μοντέλο GFP που ανακατασκεύασαν από χιλιάδες στιγμιότυπα πέτυχε ανάλυση περίπου 1,2 νανόμετρων (12 ångström). Αυτό απέχει ακόμη από την ανάλυση 1,9 Å της GFP που είναι διαθέσιμη σε δημόσια αποθετήρια και προσδιορίστηκε με κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ, όμως η ομάδα σημειώνει ότι βελτιώσεις στη μεθοδολογία έχουν ήδη οδηγήσει την ανάλυση κάτω από 10 Å για καθαρές πρωτεΐνες.
«Προσπαθούμε να δημιουργήσουμε δομές τύπου cryo-EM από προσιτά οπτικά μικροσκόπια», δήλωσε ο Άλι Σάιμπ, ειδικός στη νανοκλίμακα στο UMG.
Ο εκδημοκρατισμός της δομικής βιολογίας
Η σημαντικότερη συνέπεια αυτής της εξέλιξης είναι η δυνατότητα διεύρυνσης της πρόσβασης στη δομική βιολογία. Ενώ τεχνικές όπως η cryo-EM και η κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ απαιτούν ακριβό εξοπλισμό και εξειδικευμένη τεχνογνωσία, η μικροσκοπία επέκτασης μπορεί να εφαρμοστεί με συμβατικά εργαστηριακά όργανα.
«Φτάνουμε σε μια περιγραφή θεμελιώδους αλήθειας για το τι είναι μια πρωτεΐνη», πρόσθεσε η συν-συγγραφέας Χελένα Χου, βιομηχανικός στο MIT.
Η μέθοδος ανοίγει τον δρόμο για την κατανόηση της δομής πρωτεϊνών που παραμένουν αχαρτογράφητες, με πιθανές εφαρμογές στην ανακάλυψη φαρμάκων, την κατανόηση ασθενειών και την ανάπτυξη νέων βιοτεχνολογικών εργαλείων. Το γεγονός ότι η τεχνική μπορεί να εφαρμοστεί ακόμη και σε πρωτεΐνες εντός κυττάρων, σε ανάλυση περίπου 10 Å, την καθιστά ιδιαίτερα πολύτιμη για τη μελέτη βιολογικών διεργασιών στο φυσικό τους περιβάλλον.